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如何预防植物组培中经常遇到的污染现象?

一、污染原因

污染是指在组织培养过程中,由于真菌、细菌等微生物的浸染,在培养容器内滋生大量的菌斑,使培养材料不能正常生长和发育的现象。

在组织培养中污染是经常发生的,造成污染的原因也很多,主要有:

1、培养基及各种使用器具消毒不彻底;

2、外植体灭菌时不彻底,有菌残存在细胞中;

3、操作时人为因素带入;

4、环境不清洁;

5、超净工作区域污染。

     在组织培养实验室中,污染的病原分为细菌及真菌两大类。操作者最好根据污染的情况做出判断,搞清到底是细菌污染,还是真菌污染,以便采取相应的措施进行处理。

细菌污染的主要待征是,在培养过程中,培养基或外植体上出现黏液状或水迹状物,有时需要仔细辨认才能看清。这种症状表明,所受的污染可能是细菌污染,在接种1~2d即可发现。细菌污染主要是由于培养基灭菌不够彻底,材料带菌或在接种操作时没有对外植体进行彻底灭菌所致。主要是工作人员使用了未经充分灭菌的工具(镊子、培养皿等)及呼吸时呼出的细菌所引起的。也可能是手接触材料或器皿边缘,使微生物落入材料或器皿,要求操作人员严格按照无菌操作程序操作。

 

二、污染的预防措施

要定期对接种环境进行熏蒸消毒,所有器具均需进行高温灭菌后才能使用。要定期对超净工作台的初过滤器进行清洗和更换。在使用超净台前开启通风装置并打开紫外灯灭菌20min,操作前用75%酒精擦拭整个操作台面,接种前,工作人员必须很好地洗手,还要用70%酒精棉球擦拭双手。在每次接一两瓶材料后,最好再用酒精擦一下手指,接种用的镊子和解剖刀或接种针也要经常在酒精灯的火焰上烧灼灭菌(但必须冷却后才能用于接种材料)。材料接种好以后,将瓶口置于火焰上转动,使瓶口各部分都烧到,目的是固定或杀死留在瓶口上的细菌及避免灰尘污染瓶口。研究蓝莓组织培养时,主张不要在超净工作台里使用酒精灯等灯具。这样会因热的火焰引起的空气对流而破坏超净台里本来规则的空气层流,使本来存在于超净台底层的微粒被带到上层,带来更多的污染机会。

在用茎尖作外植体时,可在室内或无菌条件下对枝条进行预培养。如将枝条用水冲洗干净后插入无糖的营养液或自来水中,使其抽枝,然后以这种新抽的嫩枝条作为外植体,可大大减少材料的污染。或在无菌条件下对采自户外的枝条进行暗培养.待抽出较长的新生枝条时再采取枝条,也可明显减少污染。此外,避免阴雨天在户外采取外植体。在晴天采材料时,下午采取的外植体要比早晨采的污染少,因材料经过日晒后可杀死部分细菌或真菌。

由于植物组织培养中材料只能进行表面灭菌,表面消毒并不能除掉所有的病菌,有些病菌可以侵入材料内部,尤其是木本植物,材料内部易感染病菌,因而必须在培养基中加入抗生素类来有效控制这类污染。但应注意抗生素对某些种类的植物生长有抑制作用,至于植物该使用哪一类抗生素,用多大浓度才适宜,要在实践中去摸索。周凤娇等研究彩色马蹄莲组织培养时,在培养基中添加了不同种类不同浓度的抗生素,发现50mg/L硫酸链霉素抑菌效果最好。蔡坤秀等研究芦笋组培苗继代时,采用四种抗生素处理来防治细菌污染,多种抗生素都能抑制细菌的污染,其中以卡那霉素抑制效果最好。

此外.所用的培养基一定要在培养室中预培养2~3d.然后再进行检验,确定无细菌感染的迹象后才能使用。为了防止因接种而造成细菌,应该对初代培养、继代培养的繁殖材料进行系统地检查,发现有被细菌污染的迹象时,应该将其清除。

真菌污染的识别方法是,在接种后,培养基或外植体表面出现白、黑、绿等色的块状真菌孢子,其蔓延速度较快,在接种3~10d后才可发现。真菌污染比较容易通过空气、培养容器、瓶口进行污染,因此要加强对空气的灭菌管理,在每次操作前,最好先用紫外线灯灭菌20~30min,再用75%的酒精对容器材料表面进行喷雾灭菌。此外,外植体的褐变有时也是造成培养基或被培养物污染的原因之一。


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